钠死亡？？？是滴，你没听错，就是那个离子通道钠钾离子的钠！哎嘿！近期，上海交大团队首次揭示全新细胞死亡机制---钠死亡 (NECSO)……为何称为钠死亡？真的时一种新型死亡方式么？如何检测？速戳！

01 Na+/Ca2+ 超载经过调研 (掐指一算)，科学家对于生物膜离子通道的研究可谓由来已久。

从 1952 年，首次提出离子通道的概念，到 1991 年，科学家因发现细胞内离子通道、开创膜片钳技术获得诺贝尔生理或医学奖。此后，人们对离子通道在血管/大脑发育、疾病发展等过程中的重要作用做了诸多研究，当然还包括新型离子通道的发现，例如 ENaC——一种控制咸味感受的钠离子通道[1]。

钠浓度受 Na+–K+-三磷酸腺苷酶 (ATPase) 和离子通道的严格调节，在人体组织损伤中，常见到钠流入和过载的现象。例如心力衰竭，其特征是细胞内 Na+ 超载[2][3]。失调的钠流入会破坏渗透平衡，导致与组织损伤、中风和肿瘤等疾病相关的组织水肿。钠过量还会导致高血压、脑水肿、糖尿病等严重的人类疾病[4]。Buttttt！不解之谜还是很多，我们知道，铜死亡 、铁死亡皆为 Cu2+/Fe2+ 的过度积累/超载导致。那么，钠超载是否也会引发细胞死亡？

PS：其实这种思路也并不奇怪，铁死亡等的发现启发了研究者们对其他功能性金属离子的进一步探索以及开发有效的癌症治疗新策略。

钙超载

2019 年的一篇研究发现：向肿瘤病灶投入经修饰的过氧化钙纳米颗粒 (SH-CaO2 NPs)，能使肿瘤丧失钙调节能力，产生"钙超载"效应，达到抑制肿瘤的作用，并首次提出了新型肿瘤治疗策略——离子干扰疗法[5]。

图 1. SH-CaO2 NPs 功能模式示意图[5]。

02 钠死亡 (NECSO)近期，上海交通大学医学院钟清团队与中科院上海药物所李扬团队在 Nature Chemical Biology 上发表论文 Persistent activation of TRPM4 Triggers necrotic cell death characterized by sodium overload。该研究发现并定义了一种以钠超载为主要特征的新型细胞坏死—钠死亡 (NECSO: Necrosis by sodium overload)[6]。

图 2. TRPM4 的持续激活会引发以钠超载为特征的坏死性细胞死亡[6]。

小分子化合物 NC1 通过结构类似于其他 TRP 家族蛋白中发现的配体结合调节口袋的口袋，作为 TRPM4 的高选择性激动剂。NC1 持续激活 TRPM4 通道活性。因此，TRPM4 通道不受控制的开放会导致大量钠内流和膜去极化，导致坏死性细胞死亡，作者将其称为 NECSO，以区别于其他类型的坏死性细胞死亡。故事还要从一个小分子化合物的发现说起…… (无废话！可放心"食用" )

▐ NC1 诱导剂的发现

2023 年 4 月，研究者从先前报道的抗肿瘤化合物的优化衍生物中鉴定出一个小分子化合物，将其命名为坏死剂 1(Necrocide-1, NC1)[7]。NC1 是一种肿瘤坏死因子 (TNF) 非依赖性坏死的实验诱导剂，在体内外，仅在纳摩尔浓度下可杀死人类癌细胞，并且具有非凋亡的坏死形态 (图 3)。

图 3. NC1 的死亡诱导作用[6]。

a. 化合物 NC1 的化学结构。b. NC1 在处理 48 小时后的各种细胞系中的 IC50。

▐ 死亡形式：是已知的？还是新的？

既然 NC1 能诱导细胞死亡，何种形式的死亡？是否属于已有死亡形式的一种？追根溯源，小 M 简单梳理了研究者是如何逐步将其确定为钠死亡的大致思路！

首先，利用 Sytox Green (一种仅染色死细胞，但不会染色活细胞的染料) 进行活细胞成像分析，成功地观察到了在细胞死亡期间发生的 NC1 处理细胞的急剧气球状增大 (图 4)。也就是说，经 NC1 处理后的 MCF-7 细胞可能发生坏死而不是凋亡。

图 4. 在含有 SytoxGreen 的培养基中用 50 nM NC1 处理的 MCF7 细胞的活细胞图像[6][7]。

随地大小考为什么该实验证明了 NC1 诱导发生坏死而不是凋亡？细胞凋亡：细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体。细胞坏死：细胞膜破损，染料可进入染色。

点击空白处出现答案

同时，广谱胱天蛋白酶抑制剂 Z-VAD-fmk、自噬抑制剂氯喹 (Chloroquine , CQ) 和 3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine , 3-MA) 以及坏死凋亡抑制剂坏死抑素-1 (Necrostatin-1 , Nec1) 均未能抑制 NC1 诱导的细胞死亡，这表明 NC1 诱导的坏死不同于细胞凋亡、自噬性细胞死亡和坏死性凋亡。此外，铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 (Fer1)、铁螯合剂 Liproxstatin-1 (Lipro) 和去铁胺 (Desferrioxamine，DFO) 以及细胞焦亡抑制剂 z-YVAD 均未能抑制 NC1 诱导的细胞死亡（图 5)。

图 5. NC1 诱导细胞死亡的活力热图[6]。

用 20 μM Z-VAD-FMK (Z-VAD)、10 μM Necrostatin-1 (Nec-1)、50 μM 氯喹 (CQ)、50 μM 3-甲基腺嘌呤 (3-MA)、1 μM Ferrostatin-1 (Fer-1)、1 μM Liproxstatin-1 (Liprox-1) 或 100 μM 去铁胺 (DFO) 预处理 1 小时，然后用 100 nM NC1、RSL3、50 ng/ml TNF-α + 1 μM Smac Mimetic (TS) 或 TS + 20 μM Z-VAD (TSZ) 处理 24 小时的细胞活力热图。

当然，研究者们还进行了细胞焦亡效应物 GSDMD 的缺失、ACLS4 的抑制等多种检测，以及使用包括 NSA、zVAD-fmk 和 z-YVAD 在内的不同细胞死亡途径的联合抑制，进一步排除全凋亡等复杂死亡形式的影响。

种种数据表明：NC1 诱导的坏死代表了除细胞凋亡、自噬、坏死性凋亡、铁死亡、细胞焦亡和单核细胞死亡之外的另一种未描述的细胞死亡途径-- NC1 引发了真正的坏死途径。

03 NC1 诱导钠死亡的机制？▐ 靶点现身：TRPM4

为了揭示其分子机制，研究者们在稳定表达 Cas9 的 NC1 敏感 MCF7 细胞中进行了全基因组 CRISPR-Cas9 筛选 (图 6a)。

哎嘿！TRPM4 在 CRISPR 筛选中名列前茅！！！始终显示出非凡的富集分数 (图 6b)。表面等离子体共振 (SPR) 分析 证实 NC1 直接与 TRPM4 结合，亲和力为 0.88 μM (图 6c)。此外，全细胞膜片钳记录表明，NC1 强烈诱导 TRPM4 依赖性电流 (EC50 ≈ 306.3 nM)，并触发 TRPM4 的持续激活。

图 6. NC1诱导细胞死亡的活力热图[6]。

a. 全基因组 CRISPR-Cas9 筛选策略示意图。b. 在CRISPR–Cas9 筛选中，用 MAGeCKFlute-RRA 分析 NC1 处理组和对照组的 sgRNA 靶基因的 Beta 分数和错误发现率 (FDR)。c. 使用尺寸排阻色谱法纯化 hTRPM4（inset)。纯化的蛋白质以剂量依赖性浓度（Conc.）加载并用考马斯亮蓝 (CBB) 染色。SPR 测量显示 NC1 与 hTRPM4 蛋白结合。

其实吧，TRPM4 这“哥们儿”是一种钙激活的非选择性单价阳离子通道蛋白。作者使用电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS) 分析了细胞内 Na、K、Ca、Mg 和 Fe 的主要金属水平。发现经 NC1 处理后，钠水平升高而钾水平降低，即钠流入和钾流出强劲。当然，离子敏感探针也证实了这些变化。问题来了，如何判断是钠流入还是钾流出导致 NC1 诱导的坏死呢？

▐ 钠流入 VS 钾流出首先使用 NC1 诱导其在不含血清和氨基酸的等渗细胞外缓冲溶液 (EBS) 中的杀伤活性。先说钾，将细胞外钾浓度从 5 mM 提高到 25 mM，并不会影响细胞死亡 (啧啧，无伤大雅 )。再来看看钠这边，将培养基中的 NaCl 替换为 N-甲基-d-葡糖胺 (NMDG-Cl，一种维持渗透压的非渗透性阳离子)。没了钠，NC1 诱导的细胞死亡被显著阻断 (图 7)。同时，钠超载还会增加细胞内渗透压，导致水流入、细胞肿胀和水肿。

图7. 钠流入是 NC1 诱导细胞死亡的重要事件[6]。

a. 用 50 nM NC1 在不同 EBS 中处理的 MCF7 细胞的代表性延时图像：正常、KCl 浓度增加至 25 mM、无钙和无钠（渗透压由相同浓度的 NMDG-Cl 维持）。比例尺，25 μm。b. 用 NC1 在不同 EBS 中处理 6 小时的 MCF7 细胞的细胞活力，如 a 中所述。c. 用 ICP-MS 评估用 50 nM NC1 在不同 EBS（正常、无钠和 25 mM KCl）中处理 3 小时的 MCF7 细胞中的钠和钾水平。结果绘制为对照的倍数变化。

So，钠流入很关键，这种坏死性细胞死亡对钠流入具有依赖性。新名称由此诞生！研究者们将这种特定类型的坏死称为钠坏死 (NECSO)。

当然，还有一些其他的发现：TRPM4 KO 可消除钠流入，且 NC1 特异性激活人类 TRPM4 (hTRPM4)，而不是小鼠 TRPM4。虽然 hTRPM4 和 mTRPM4 具有 88.4% 的序列相似性和相似的四聚体结构， 但它们的 NC1 敏感性截然不同，这是由于跨膜区域的差异导致的。也就是说，NC1 是 hTRPM4 的高度特异性激动剂，使 NECSO 仅在表达 hTRPM4 的细胞中起作用。

此外，TRPM4 突变与心律失常有关，在对心律失常相关的人类 TRPM4 的功能获得性突变 (GOF) 研究显示，对由 NC1 或 2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）引发的 NECSO 的易感性增加。另一方面，TRPM4 失调与缺血和脊髓损伤等情况下的 ATP 耗竭有关，进一步的化学筛选发现 NECSO 抑制剂可阻断 NC1 或能量耗竭引起的坏死。

接下来，就到了筛选小分子抑制剂的时刻！！！

▐ 双策略：NECSO 小分子抑制剂的鉴定

为了鉴定 NECSO 的小分子抑制剂，使用了新鉴定的 TRPM4 的 NC1 结合位点进行计算机筛选。发现抗真菌药物克霉唑 (Clotrimazole , CLT) 具有与 NC1 相似的结构，并且能很好地融入结合腔 (图 8)。在 MCF7 细胞中的测试证实了 CLT 的效力，EC50 为 4 µM (图 9)。其对 TRPM4 的抑制作用也通过电生理学得到证实。

图 8. CLT 具有与 NC1 相似的结构，作为 NECSO 的小分子抑制剂发挥作用[6]。

a-b. NC1 结合 hTRPM4 的特异性识别。3D 图显示 NC1 与 TRPM4 的 S3、S4、S5′ 和 S6′ 螺旋之间的深腔结合；Ca2+ 以紫色表示 (a)。2D 图显示 NC1 通过氢键、疏水相互作用和 π-π 堆积的混合作用与 TRPM4 的关键残基相互作用 (b)。c. 显示分子建模 TRPM4-NC1 复合物的整体结构的表面表示。MW，分子量。插图：NC1 结合位点的特写视图。单个 TRPM4 亚基以青色或灰色表示，而 NC1 以黄色突出显示。d. 左：3D 图显示 CLT 特异性结合 hTRPM4，识别出与 NC1 类似的深腔。右：2D 图显示 CLT 通过氢键和疏水相互作用与 TRPM4 的关键残基相互作用。

滴滴！第二种策略来咯~聪明的你一定能想到：化合物库的筛选 ！--嘿嘿，不瞒你说，MCE 也是很擅长滴！作者选择了美国食品药品管理局 (FDA) 批准的 1,376 种分子药物库，发现二氢吡啶 (Dihydropyridines，DHPs；一种已知的钙通道阻滞剂，靶向 L 型电压门控钙通道 (LTCC))，在 MCF7 细胞中表现出强大的 NECSO 抑制作用。如图 9 所示，Cilnidipine、Lacidipine、Benidipine、Lercanidipine 均为二氢吡啶类钙通道阻断剂。

图 9. DHPs 作为 NECSO 的小分子抑制剂发挥作用[6]。

CLT 和 DHP 对 NC1 诱导的细胞死亡具有抑制作用。用浓度不断增加的 CLT 或 DHP 预处理 MCF7 细胞，然后用 100 nM NC1 处理，24 小时后使用 CTG 评估细胞活力。

机制上，DHPs 和 CLT 通过不同的机制阻断 NECSO：DHP 通过靶向 LTCC 来抑制 NECSO，从而阻止 TRPM4 激活，而 CLT 通过直接与 NC1 竞争其在 TRPM4 上的结合口袋来阻断 NECSO。此外，DHP 和 CLT 这两种抑制剂在 Cos7 细胞中比Glimepiride更有效地降低 NC1 和能量耗竭诱导的 NECSO。它们还保护表达 TRPM4 GoF 突变体的心肌细胞免受能量耗竭。

04 钠死亡：如何检测？当然，如果有小伙伴对钠死亡感兴趣，NC1 诱导死亡后如何检测呢？咳咳！小 M 在这里也给大家整理了一种方式：

文献表明，在 NC1 能诱导细胞死亡的过程中，膜去极化和渗透不平衡引起的细胞肿胀是 NECSO 的典型特征[6]。

作者使用透射电子显微镜 (TEM) 检测发现，在 NC1 处理的细胞中，细胞器 (包括线粒体、内质网和高尔基体) 严重肿胀，并且膜破裂 (图 10)。

图 10. NECSO 伴有膜去极化和细胞水肿[6]。

用 100 nM NC1 在不同时间点处理的 MCF7 细胞的透射电子显微镜 (TEM)。比例尺，500 nm。0.5、1.5 和 2.5 小时图像中的红色箭头分别代表肿胀的线粒体、内质网和高尔基体，并在 4 小时图像中突出显示肿胀的核膜 (上) 和破裂的细胞膜 (下)。

▐ TEM 分析操作 (供参考[6])：01MCF7 细胞在不同时间点用 100 nM NC1 处理，然后用含有 2% 多聚甲醛、3% 戊二醛和 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液 (Cacodylate buffer) 的固定液 (pH 7.3) 固定。02随后，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 (Sodium cacodylate buffer) 清洗细胞，并用 0.1% 过滤的二甲胂酸盐缓冲单宁酸 (Cacodylate-buffered tannic acid) 处理。03然后，用 1% 缓冲锇 (Buffered osmium) 固定，并用 1% 过滤的乙酸铀酰 (Uranyl acetate) 染色。04脱水后，将样品在 37℃ 进行 Epon 树脂处理 6 小时 (最终浓度100%)。然后将它们嵌入纯 Epon 中并于 60 °C 下放置过夜。05使用 Leica EM UC7 超薄切片机制备切片，将切片置于覆有涂有 Formvar 涂层的 TEM 网格 (Gilder Grids, AG100N) 上，用 3% 乙酸铀酰 (Uranyl acetate) 和柠檬酸铅 (Lead citrate) 染色。06采用 PHILIPS CM-120 型透射电子显微镜 (工作电压 80 或 120 kV) 进行观察分析。

05 小结无需再滑，到此结束！本期为大家介绍了又一全新的细胞死亡方式—钠死亡！文献中所使用的 SPR 检测服务、分子库的筛选以及众多实验试剂 MCE 都有滴~可在 MCE 官网搜索查看，正值开学季，优惠多多。老样子，感兴趣的小伙伴点赞收藏喔~

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Clotrimazole (HY-10882)

Clotrimazole 是咪唑衍生物，有抗真菌活性，是 P450 抑制剂。Clotrimazole 还具有抗菌活性。

[1] Chandrashekar J, et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 2010 Mar 11;464(7286):297-301.

[2] Trum M, et al. Cardioprotection by SGLT2 Inhibitors-Does It All Come Down to Na+? Int J Mol Sci. 2021 Jul 26;22(15):7976.

[3] Despa S, et al. Na⁺ transport in the normal and failing heart - remember the balance. J Mol Cell Cardiol. 2013 Aug;61:2-10.

[4] Aksentijevic D, et al. Is there a causal link between intracellular Na elevation and metabolic remodelling in cardiac hypertrophy? Biochem Soc Trans. 2018 Aug 20;46(4):817-827.

[5] Zhang, Meng et al. Calcium-Overload-Mediated Tumor Therapy by Calcium Peroxide Nanoparticles. Chem, Volume 5, Issue 8, 2171 – 2182.

[6] Fu W, et al. Persistent activation of TRPM4 triggers necrotic cell death characterized by sodium overload. Nat Chem Biol. 2025 Feb 6 .

[7] Zhang J, et al. Necrocide 1 mediates necrotic cell death and immunogenic response in human cancer cells. Cell Death Dis. 2023 Apr 5;14(4):238.

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